SFB 449 III: Strukturelle und funktionelle Aspekte bakterieller Substratrezeptoren (Teilprojekt B 14)

ABC (ATP-binding cassette)-Proteine kommen in allen Organismen vor und bilden eine der größten Proteinfamilien. ABC-Transporter sind nach einem gemeinsamen Prinzip aufgebaut: zwei hydrophobe Transmembran-Domänen bilden mit zwei ATP-spaltenden (ABC-) Domänen einen Komplex aus. Prokaryotische ABC-Transporter, die die Aufnahme verschiedenster Nährstoffe in das Cytoplasma ermöglichen, sind für das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit essentiell. Im Gegensatz zu Exportsystemen benötigen Importer eine zusätzliche Proteinkomponente, einen extrazellulären Substrat-Rezeptor (Bindeprotein). Während des Transportzyklus tritt das substratbeladene Protein in Wechselwirkung mit den Membrankomponenten, wodurch Konformationsänderungen eingeleitet werden, die zur ATP-Hydrolyse an den ABC-Domänen und letztlich zur Translokation des Substrates führen. Einige Substrat-Rezeptoren sind darüberhinaus an der Signaltransduktion bei der Chemotaxis sowie an genregulatorischen Vorgängen beteiligt. Außerdem besteht Sequenzähnlichkeit zu Ca2+- und Glutamatrezeptoren aus Säugerzellen. Bindeproteine weisen eine hohe Spezifität sowohl gegenüber ihrem Substrat als auch dem zugehörigen membranständigen Transportkomplex auf. Über die Kontaktflächen zwischen Bindeprotein und den Untereinheiten des Transporters ist jedoch trotz vorhandener Kristallstrukturen nur wenig bekannt. Am Beispiel des Histidin-ABC-Transporter aus Salmonella typhimurium wollen wir die an der Wechselwirkung beteiligten Aminosäurereste identifizieren. Im Gegensatz zu den meisten anderen Systemen übernimmt hier der Membrankomplex HisQMP2 die Substrate von zwei Bindeproteinen mit hoher Affinität für Histidin (HisJ) bzw. Lysin/Arginin/Ornithin (LAO). Über Bindungsexperimente mit synthetischen Peptiden, die von HisQM abgeleitet sind ('pepscan'), sollen interagierende Proteinbereiche kartiert werden. Identifizierte Peptide sollen danach in kompetitiven Funktionsanalysen genauer charakterisiert werden. Die Struktur der Peptide soll durch multidimensionale NMR-Spektroskopie und molekulare Modellierung bestimmt werden. In einer vergleichen Analyse wollen wir ähnliche Experimente auch mit dem Arginin-Transporter aus dem thermophilen Bakterium Geobacillus stearothermophilus durchführen. Substrat-Bindeproteine acidophiler Mikroorganismen sind geeignete Modellsysteme für Untersuchungen zur Säurestabilität von Proteinen. Aufbauend auf der Kristallstruktur des Maltose-Rezeptors aus Alicyclobacillus acidocaldarius, die einen gegenüber 'neutrophilen' Proteinen erhöhten Anteil an polaren, ungeladenen Aminosäureresten sowie eine hohe positive Oberflächenladung ergab, sollen Experimente zur Überprüfung des Zusammenhangs mit Säurestabilität durchgeführt werden. Dazu sollen gezielt Mutantenproteine mit veränderten Stabilitätseigenschaften isoliert werden. Von besonders interessanten Kandidaten soll die Kristallstruktur ermittelt werden. Zur Klärung der Frage, ob die beobachteten Eigenschaften nur auf den Maltose-Rezeptor beschränkt sind, wollen wir darüberhinaus auch die Struktur eines Sulfat-Rezeptors aus dem selben Organismus lösen. Die Wechselwirkung zwischen dem Bindeprotein und dem Transportkomplex kann durch den Inhibitor Vanadat stabilisiert werden, so dass ein Superkomplex isoliert werden kann. Mit Hilfe der Cryo-Elektronenmikroskopie wollen wir strukturelle Unterschiede zum rezeptorfreien System am Beispiel des Maltose-Transporters aus Salmonella typhimurium aufklären.