SFB 498 I-III: Schlüsselreaktionen der biologischen Wasserstoffaktivierung am Beispiel der [NiFe]-Hydrogenasen (Teilprojekt C 10)

Die biologische Spaltung von H2 ist ein in Prokaryoten und niederen Eukaryoten weit verbreiteter Stoffwechselprozess, der durch zwei Klassen von Metalloenzymen, die [NiFe]- und die [Fe]-Hydrogenasen, katalysiert wird. Im Mittelpunkt dieses Projektes stehen die drei funktionell unterschiedlichen [NiFe]-Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus). Es handelt sich dabei um die regulatorische Hydrogenase (RH), die NAD-reduzierende, lösliche Hydrogenase (SH) sowie die membrangebundene Hydrogenase (MBH). Das Arbeitsprogramm umfasst die drei folgenden Aspekte:<br>
-Im Vordergrund der molekulare Analyse der initialen Schritte der H2-Sensierung steht die Identifizierung des neuartigen Redox-Kofaktors. Desweiteren soll dessen Interaktion mit verschiedenen funktionellen Domänen der RH untersucht werden. Ausgewählte RH-Mutantenproteine, die Veränderungen im Gastransport zum aktiven Zentrum bzw. im Elektronen- und Protonentransfer aufweisen, werden eingehend mit einer Vielzahl von biochemischen und spektroskopischen Methoden charakterisiert. Unter Einbeziehung neuer Reinigungsstrategien sollen die Versuche zur Gewinnung von RH-Kristallen für die Röntgen-Strukturanalyse weitergeführt werden.<br>
-Die Studien an den beiden Energie-wandelnden Hydrogenasen (SH und MBH) werden sich auf die weitergehende Charakterisierung des [NiFe]-Zentrums konzentrieren, welches im Fall der SH zwei zusätzliche diatomare CN--Liganden enthält. Es soll untersucht werden, inwieweit dieses veränderte Zentrum für die besonderen spektroskopischen und katalytischen Eigenschaften der SH, vor allem für die ausgeprägte O2-Toleranz des Enzyms, verantwortlich ist.<br>
-Die Assemblierung des in seiner Struktur einzigartigen [NiFe]-Zentrum erfordert eine Kaskade von Reifungsschritten, die durch die sogenannten Hyp-Proteine katalysiert wird. Um den Prozess der Einbettung des Kofaktors in die Proteinmatrix besser zu verstehen, haben wir ein neues Projekt in unserer Arbeitsprogramm aufgenommen. Die Experimente werden sich auf zwei Fragestellungen konzentrieren: (i) Ist das HypX-Protein für die Insertion der zusätzlichen diatomaren Liganden verantwortlich und dient ein Derivat von Tetrahydrofolat als C1-Gruppen-Donator? (ii) Ist eine verkürzte Version des HypF-Proteins, der zwei konservierte Domänen fehlen, ausreichend für die Insertion der diatomaren Liganden in das katalytische Zentrum? Für die Beantwortung dieser Frage, werden sowohl das verkürzte HypF1-Protein, das in der MBH-Genregion kodiert wird, als auch das prototypische HypF2-Protein aus der SH-Genregion einer Kombination aus in vivo- und in vitro-Experimenten unterworfen.