Humboldt-Universität zu Berlin

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Rhodopsin-Guanylyl-Zyklase (RGC) aus dem Pilz Catenaria anguillulae (Ca) spektroskopisch untersucht. RGCs gehören zur Familie der Enzymrhodopsine, welche sich durch eine Lichtregulation ihrer Enzymaktivität durch ein Rhodopsin (Rh) auszeichnen. Das membranständige Rh ist hierbei mit einer Guanylylzyklase (GC) verbunden. Letztere setzt GTP zu dem wichtigen sekundären Botenstoff cGMP um sobald das Rh durch Licht aktiviert wird. Botenstoffe wie cGMP spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen in nahezu allen Lebewesen, inklusive dem Menschen. Dadurch wird RGC interessant für optogenetischeAnwendungen, da es die Möglichkeit bietet die Signalwege wichtiger Botenstoffe zu erforschen. Eine detaillierte Kenntnis der Funktionsmechanismen von RGC könnte so zu einem tieferen Verständnis von Protein-Enzym-Interaktionen führen und den Weg zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge und nicht zuletzt medizinisch nutzbaren Erkenntnissen weisen. Die Funktionsweise von Enzymrhodopsinen war jedoch weitestgehend unklar. In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen ein mechanistisches Modell der Aktivierung eines Enzymrhodopsinsaufzustellen.

Dazu wurde zunächst ein vielseitig einsetzbarer spektroskopischer Messaufbau zur Untersuchung lichtsensitiver Proteine entwickelt der die parallele Aufzeichnung von UV-Vis- und FTIR-Daten gestattet. Der integrierte Hochleistungspulslaser ermöglicht die praktisch simultane Anregung der Proteinproben. Zur Temperaturkontrolle wurde zudem ein Hochdruck-Heliumkryostat integriert, der Messungen bis unterhalb des Siedepunkts von Helium unterstützt und so auch ultraschnelle Prozesse erfassbar macht. 

Obwohl der Aufbau erfolgreich an verschiedenen Photosystemen angewandt wurde, lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Untersuchung von CaRGC. Nach einer spektroskopischen Charakterisierung des Photozykluswurden verkürzte Varianten untersucht um die Rh-GC Wechselwirkung zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine aktive Rolle des N-Terminus in der Enzymregulation und nur marginale Änderungen der GC-Struktur während der Aktivierung. Außerdem wurde der Substratumsatz von freiem GC und lichtaktiviertem RGC untersucht. Dazu wurde ein nichtumsetzbares GTP-Substrat verwendet, das durch Applikation von UV-Licht zu freiem GTP umgewandelt wird. Die Ergebnisse erlaubten die erstmalige Identifizierung des aktiven Proteinzustands. Entgegen bisheriger Annahmen wurde gezeigt, dass GTP schon vor Lichtaktivierung an RGC bindet. Die Aktivierung erfolgt demnach nicht wie bisher angenommen durch Öffnung des aktiven Zentrums, sondern direkt über Modifikationen in der Bindetasche.

Abschließend wurde anhand von Sekundärstrukturvorhersagen ein Aktivierungsmechanismus skizziert, der sowohl die hier vorgelegten Ergebnisse, als auch Ergebnisse vorhergehender Untersuchungen kombiniert.