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Humboldt-Universität zu Berlin

Robert Ohlendorf

Humboldt-Preis für seine Masterarbeit

From Dusk till Dawn: One-Plasmid Systems for light regulated Gene Expression

 

Zusammenfassung

 

Textfeld:  Ein grundlegendes Prinzip der wissenschaftlichen Erforschung biologischer Systeme im Labor ist die gezielte Veränderung bestimmter Parameter und die Untersuchung der dadurch hervorgerufenen Effekte. Auf Ebene der Zelle werden diese Veränderungen durch Deletion, Überexpression oder Mutation einzelner Gene sowie durch Applikation pharmakologischer Wirkstoffe erreicht. Diese Methoden weisen jedoch entweder einen Mangel an Spezifität oder Geschwindigkeit auf. In der Optogenetik werden genetisch kodierte, lichtsensitive Proteine zur Kontrolle zellulärer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verwendet. Von besonderem Interesse für optogenetische Anwendungen sind sensorische Photorezeptoren, das heißt Proteine, die Lichtsignale aus der Umgebung in eine biologische Antwort innerhalb der Zelle umwandeln. Die funktionelle Vielfalt natürlicher Photorezeptoren und die Möglichkeit neue, synthetische Photorezeptoren zu konstruieren, erlaubt die Regulation zellulärer Signalwege verschiedenster Art.

 

In meiner Arbeit wurde der synthetische Photorezeptor YF1 zur lichtregulierten Expression von Zielgenen in Escherichia coli verwendet. In Abwesenheit von Blaulicht aktiviert YF1 das Adapterprotein FixJ, welches wiederum die Genexpression durch den FixK2 Promotor induziert. Diese Komponenten sind im Plasmid pDusk vereint und führen in Abwesenheit von Blaulicht zur Expression von beliebigen Genen die in das System integriert werden. Die Applikation von Blaulicht hingegen führt zur Inaktivierung von YF1 und folglich auch der Genexpression in pDusk. Durch Einfügen einer zusätzlichen Genkassette wurde das komplementäre System pDawn konstruiert, welches durch Blaulicht aktiviert wird. In vivo lässt sich die Genexpression und deren gegensätzliche Lichtabhängigkeit in pDusk und pDawn durch die Verwendung eines Gens, welches ein rot fluoreszierendes Protein kodiert, quantifizieren. Während in pDusk die Genexpression durch Blaulicht maximal um den Faktor 12 reprimiert wird, kommt es in pDawn zu einer 460-fachen Induktion durch Blaulichtapplikation. Dieser große dynamische Bereich von pDawn ist vor allem durch eine extrem geringe Hintergrundaktivität bedingt. Quantitative Messungen der roten Fluoreszenz einzelner Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie zeigen eine binäre und konzertierte Schaltung beider Systeme innerhalb von Zellpopulationen. Das Niveau der Genexpression kann dabei in pDusk sowie pDawn durch Variation der Blaulichtintensität oder der Beleuchtungszeit präzise adjustiert werden. Im Vergleich zu bisher publizierten lichtregulierten Genexpressionsystemen sind pDusk und pDawn unabhängig  von externen Kofaktoren und bieten hohe Induktionsfaktoren. Wie in meiner Arbeit gezeigt, kann insbesondere pDawn zur Proteinproduktion im präparativen Maßstab verwendet werden. Da die Induktion von Genexpression durch Licht kosteneffizient und leicht zu automatisieren ist stellen beide Systeme nützliche Werkzeuge für die biotechnologische Industrie dar. Durch die Möglichkeit genetische Komponenten und Genprodukte in der Zelle präzise und nicht-invasiv durch Lichtapplikation zu kontrollieren erlauben pDusk und pDawn darüber hinaus die gezielte Erforschung zellulärer Signalwege in vivo.