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Humboldt-Universität zu Berlin

Franziska Schneider

Humboldt-Preis für ihre Diplomarbeit

Modifikationen an Volvox-Kanalrhodopsin 1 zur Verbesserung von Expression und Farbverschiebung

In ihrer Arbeit zeigt Frau Schneider, wie man Fragmente verschiedener Kanalrhodopsine kombinieren kann, um Hybride mit neuen Eigenschaften zu generieren. Für die Grundlagenforschung erlaubt das neue Einblicke in die Funktionsweise in die erst kürzlich entdeckte Klasse licht gesteuerter Ionenkanäle. Damit hat Frau Schneider einen wichtigen Beitrag für die Entwicklung des noch jungen Gebietes der Optogenetik geleistet.


Zusammenfassung

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkanäle, die als Fotorezeptoren in Grünalgen wirken. Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine gehörenden Proteine weisen sieben typische Transmembranhelizes auf und binden über eine Schiffsche Base das Carotinoid-Derivat Retinal. Durch Lichtabsorption isomerisiert all-trans Retinal in die 13-cis-Kofiguration. Infolgedessen ändert sich die Proteinkonformation und es bildet sich ein Kanal, durch den hauptsächlich Protonen, aber auch andere ein- und zweiwertige Kationen passiv transportiert werden.

Da ChRs lichtinduziert Membranen depolarisieren, werden sie als optogenetische Hilfsmittel zum Auslösen von Aktionspotentialen in Neuronen verwendet. Das durch blaues Licht (460 nm) aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodosin 2 (ChR2) konnte für vielfältige Untersuchungen von neuronalen Netzwerken und deren funktionalen Zusammenhängen verwendet werden. Durch ChR2-Aktivierung in spezifischen Neuronen von Caenorhabditis elegans, Drosophila und Mäusen konnten gezielt Verhaltensänderungen hervorgerufen werden. ChR2-Expression in Ganglien- oder Bipolarzellen der Retina blinder Mäuse konnte deren Photosensitivität bei hohen Lichtintensitäten wiederherstellen. Um die neurowissenschaftlichen Anwendungen auszubauen, ist ein in Bezug auf ChR2 längerwellig absorbierendes ChR dringend erforderlich. Volvox Kanalrhodopsin 1 (VChR1) kann durch grünes Licht (Maximum 548 nm) angeregt werden. Aufgrund seines geringen Expressionslevels in Neuronen sind seine Anwendungsmöglichkeiten bisher jedoch sehr eingeschränkt.

In der vorliegenden Diplomarbeit wurden verschiedene Strategien zur Verbesserung der VChR1-Expression getestet. Die untersuchten Proteine wurden als Fusionsproteine mit dem cyan-fluoreszierenden Protein in HEK-Zellen exprimiert, so dass Expressionsniveau und Membranständigkeit in konfokalen Fluoreszenzaufnahmen visualisiert werden konnten. Zusätzlich wurde eine Methode zum Vergleich der elektrophysiologisch gemessenen Fotostromamplituden entwickelt. Durch die Einführung der Punktmutation H129R sowie durch terminale Veränderungen konnten die Stromamplituden von VChR1 signifikant erhöht werden. Der Austausch einzelner Helizes gegen die homologen Sequenzen aus Volvox Kanalrhodopsin 2 (VChR2) oder ChR2 führte zu einer Verbesserung der Membranständigkeit der Proteine.

Es wurde versucht, Aminosäuren, welche die Absorptionseigenschaften der ChRs beeinflussen, zu identifizieren. Die Punktmutation F221Y sowie der Austausch der sechsten und siebten Helix führten zu einer Blauverschiebung des Anregungsspektrums von VChR1. Dagegen konnte durch Austausch der dritten und vierten Helix gegen die homologen Helizes von ChR2 eine Rotverschiebung erreicht werden.

Die vorliegende Arbeit zeigt Möglichkeiten und Schwierigkeiten bei der gezielten Veränderung von ChRs auf. Sie bildet die Grundlage für die Entwicklung optimaler ChRs für spezfische Anwendungen in den Neurowissenschaften.